Репликация ДНК и хромосонВсе, что известно в настоящее время о репликации ДНК, выяснено в результате многолетнего экспериментального обоснования основных положений модели структуры и репликации ДНК по Д. Уотсону и Ф. Крику.
Формулируя свою модель, Д. Уотсон и Ф. Крик предположили, что репликация ДНК происходит в несколько последовательных этапов, а именно: а) разрыв водородных связей между двумя полинуклеотидными цепями и разделение последних; б) разматывание по-линуклеотидных цепей; в) синтез вдоль каждой из полинуклеотидных цепей новой цепи с комплементарной последовательностью азотистых оснований (рис. 110), Они предположили далее, что разделение и разматывание полинуклеотидных цепей начинается с одного конца молекулы, продолжается по направлению к другому ее концу и сопровождается одновременно идущим с того же конца молекулы синтезом новых полинуклеотидных цепей. Таким образом, в репликации ДНК каждая по-линуклеотидная цепь действует в качестве шаблона для вновь синтезируемой полинуклеотидной цепи, причем шаблон обеспечивает выбор определенных нуклеотидных последовательностей из всех возможных последовательностей. В результате этого каждая новая молекула ДНК состоит из одной старой цепи и одной новой (дочерней), комплементарной старой. Этот способ репликации ДНК получил название полуконсервативной репликации.
Полуконсервативный характер репликации ДНК был доказан М. Месель-соном и Ф. Сталем в 1958 г. в экспериментах, выполненных на Е. coli. Выращивая бактерии в течение первых делений в синтетической среде, содержащей в качестве источника азота 15N («тяжелый» изотоп), а затем с среде с 14С («легким» изотопом), они показали, что ДНК бактерий после одной генерации роста имела «гибридную» плотность (15N/14C), а после двух генерации по плотности наполовину была «гибридной», наполовину «легкой» (14С), т.е. состояла из «тяжелых» и «легких» полинуклеотидных цепей.
У прокариотов репликация ДНК начинается с 0-пункта репликации, со-ставленного примерно 300 нуклеотидами, и продолжается в двух направлениях, образуя репликацион-ную «вилку» (рис.111). Скорость движения «вилки», т. е. скорость полимеризации составляет 500 нук-леотидов в секунду. Удвоение молекулы ДНК происходит за 40 минут. Кроме того, у прокариотов действует механизм «вращающееся кольцо», по которому репликационная вилка двигается вокруг кольца, генерируя цепи, на которых синтезируются компле-ментарные цепи (рис. 112).
Изучение ферментативного синтеза ДНК in vitro, компонентами которого являются ДНК-полимераза, дезоксирибонуклеозид 5'-трифосфаты всех четырех азотистых оснований, ионы магния и ДНК-«затравка»,
показало, что присутствие всех этих компонентов в смеси сопровождает-ся добавлением мононуклеотидов к растущему концу цепи ДНК, причем они добавляются к 3'-гидроксильному концу «затравочной» последовательности, и цепь растет в направлении от 5'- к 3'-концу (рис. 113). Реакция катализируется ДНК-полимеразой III. После добавления в смесь ДНК-«затравки» синтез ДНК не прекращается даже тогда, когда количество вновь синтезированной ДНК достигает количества ДНК-«затравки». Если же один из компонентов в смеси отсутствует, частота полимеризации снижается во много раз. Отсутствие ДНК-«затравки» полностью исключает реакцию.
Установлено, что для репликации ДНК Е. coli in vitro необходимы белки, детерминируемые генами dna A, dna В, dna С, dna G, ДНК-гираза, а также бе-лок, связывающийся с одиночными цепями ДНК и АТФ. Комплекс реплика-тивных ферментов и белков получил название ДНК-репликазной системы (реплисомы).
Изучение ферментативного синтеза ДНК in vitro показало также, что ко-пируются обе цепи, но т. к. цепи ДНК в спирали антипараллельны, то синтез (полимеризация) одной цепи происходит в направлении от 5' к 3'-концу, тогда как другой — от 3' к 5'-концу. Синтез цепи в направлении от 5'- к 3'-концу явля-ется непрерывным, тогда как синтез в направлении от 3'- к 5'— прерывен, по-скольку синтезируются короткие сегменты в направлении от 5' к 3'-концу, ко-торые затем воссоединяются ДНК-лигазой. Короткие сегменты по 1000-2000 нуклеотидов получили название фрагментов Р. Оказаки (рис. 114). Следова-тельно, рост обеих цепей обеспечивается одной и той же полимеразой. Репли-кационная вилка асимметрична. Цепь, синтезируемую непрерывно, называют лидирующей, тогда как цепь, синтезируемую прерывно, называют «запазды-вающей». «Запаздывание» второй цепи связано с тем, что синтез каждого фрагмента Оказаки осуществляется только тогда, когда в результате продвиже-ния лидирующей цепи откроется необходимый участок цепи-шаблона.
У бактерий открыты ДНК-поли-меразы I, II, III. Главной является ДНК-полимераза III, которая отвечает за элонгацию цепей ДНК. Что касается данных ферментов, то ДНК-полимераза I заполняет бреши в запаздывающей цепи, то-гда как функция ДНК-полимеразы II не совсем понятна.
В случае синтеза лидирующей цепи у ДНК-полимеразы имеется спаренный 3'-конец, что позволяет начать полимеризацию следующей (новой) цепи. Однако для ДНК полимеразы, синтезирующей «запаздывающую» цепь, необходима «затравка», обладающая спаренным 3'-концом (3'-гид-роксильной группой). Эту затравку в виде коротких сегментов РНК синтезирует из рибонуклеотидтрифосфа-тов ДНК-примаза на ДНК-шаблоне запаздывающей цепи. Данный процесс характерен тем, что предшествующий синтез коротких сегментов
РНК «затравливает» каждую новую инициацию синтеза ДНК. Затем включается ДНК-полимераза, полимеризуя 5'-фосфатдезокси-рибонуклеотидного остатка с 3'-гидроксильным концом цепи РНК, что приводит к нормальному синтезу цепи ДНК. В последующем «затравочная» последовательность РНК удаляется, и брешь заполняется ДНК. Таким образом, роль «затравки» в синтезе фрагментов Оказаки выполняет РНК.
Репликация ДНК эукариотов характеризуется теми же механизмами, что и у прокариотов, хотя скорость полимеризации цепей является меньшей (около 50 нуклеотидов в секунду у млекопитающих). В репликации ДНК эукариотов принимают участие те же ферменты, что и в случае прокариотов. Размеры фрагментов Оказаки здесь составляют 100-200 нуклеотидов.
Раскручивание двойной цепи ДНК происходит с участием трех разных белков, а именно: а) белки, дестабилизирующие спираль (SS В-белки). Они свя-зываются с одноцепочечными ДНК, помогают
ДНК-геликазам раскручивать спираль и обеспечивают протяженный од-ноцепочечный шаблон для полимеризации; б) ДНК-гелика-зы, раскручиваю-щие ДНК. Они прямо вовлечены в катализирова-ние раскручивания; в) ДНК-гиразы, которые катализируют формирование негативных супервитков в ДНК.
У эукариотов известно пять ДНК-полимераз (, , , и ), из которых главную роль в репликации играют полимеразы и .
—Полимераза начинает синтез на ведущей (лидирующей) и запазды-вающей цепях, поскольку только она обладает «затравочной» активностью. Дальнейшую элонгацию лидирующей цепи осуществляет -фермент, а «запаз-дывающей» цепи — - или -ферменты. -фермент, который является митохон-дриальным, завершает репликацию «запаздывающей» цепи, играя при этом роль, присущую в бактериях ферменту роl I.
Установлен также белок (циклин), который синтезируется в S-фазе кле-точного цикла и который также необходим для репликации ДНК.
Спирализацию ДНК после репликации обеслечивают ферменты ДНК-топоизомеразы. Процесс репликации ДНК характеризуется исключительной точностью. Как отмечено выше, фрагменты Оказа-ки, продуцируемые в ДНК у эукариот, имеют длину от 100 до 20 пар нуклеотидов. Это, возможно, связано с тем, что у эукариотов синтез ДНК является более медленным (1 молекула ДНК в минуту) по сравнению с прокариотами (30 молекул ДНК в минуту).
Удвоение хромосом эукариотов является сложным процессом, поскольку включает не только репликацию гигантских молекул ДНК, но также и синтез связанных с ДНК гистонов и негистоно-вых хромосомных белков. Конечным этапом является упаковка ДНК и гистонов в нуклеосомы. Считают, что удвое-ние хромосом также имеет полуконсервативный характер.
Репликационное поведение хромосом основывается на трех фундамен-тальных свойствах, а именно: непосредственно репликация, сегрегация хромо-сом при репликации ДНК и делении клеток, а также репликация и предохране-ние концов хромосом. 0-пункты репликации существуют в хромосомах (сайты инициации репликации) также организмов-эукариотов, состоящих из опреде-ленных последовательностей азотистых оснований, причем являются множест-венными. Эти пункты получили название автономно реплици-рующихся после-довательностей (ars-элементов). Определяя количество репликационных вилок, они удалены один от другого на расстоянии 30 000-300 000 пар азотистых ос-нований. В результате этого по каждой хромосоме двигается много репликаци-онных «вилок», причем одновременно и независимо одна от другой. Инициа-цию репликации ДНК обеспечивают белки, связанные с 0-пун-ктом реплика-ции, а также белки — киназы. Последние ответственны за выход ДНК из реп-ликации. Но как действуют эти механизмы — это вопрос, который еще не по-лучил разрешения.
За сегрегацию хромосом в дочерние клетки ответственны центромеры.
В репликации и предохранении концов хромосом имеют значение так на-зываемые теломеры, представляющие собой повторяющиеся последовательно-сти ДНК длиной 5—10 азотистых оснований. Их роль заключается в обеспече-нии доступа ДНК-полимеразы к концам цепей ДНК. Вновь образованные хро-мосомы содержат как старые гистоны, так и вновь синтезированные, контроль которых у млекопитающих осуществляется 20 генными блоками, каждый из которых содержит по 5 гистоновых генов.
Однако репликация эукариотической ДНК имеет и существенное отличие от репликации прокариотической ДНК. Когда ДНК эукариотов метят ^-тимидином, а затем экстрагируют из хромосом и изучают методом радиогра-фии, то при этом наблюдают тан-демный порядок радиоактивности. Это свиде-тельствует о том, что одиночные молекулы ДНК содержат множественные 0-пункты репликации. Например, в ДНК клеток млекопитающих 0-пункты встре-чаются через каждые 40 000 - 200 000 пар оснований. Экспериментальные дан-ные указывают на то, что репликация хромосом эукариотов происходит в двух направлениях, поскольку реплика-ционные вилки двигаются в двух направле-ниях из центральных 0-пунктов к репликационным терминусам (пунктам оста-новки репликации). Сегмент хромосомы, чья репликация находится под кон-тролем одного 0-пункта и двух терминусов, является единицей репликации и ее называют репликоном. Размеры эукариотичес-ких репликонов зависят от вида организмов, но в общем они составляют около 10-100 нм.
|
